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Apr 19, 2024

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 474 (2023) Citare questo articolo

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La tecnologia di fresatura del fascio ionico crio-focalizzato (cryo-FIB) è stata sviluppata per la fabbricazione di crio-lamella di campioni nativi congelati per lo studio mediante tomografia crioelettronica in situ (cryo-ET). Tuttavia, la precisione del target di interesse rappresenta ancora uno dei principali colli di bottiglia che limitano l’applicazione. Qui, abbiamo sviluppato un sistema crio-correlativo di microscopia ottica ed elettronica (crio-CLEM) denominato HOPE-SIM incorporando un sistema di microscopia a fluorescenza (SIM) con illuminazione strutturata 3D e uno stadio ad alto vuoto aggiornato per ottenere crio-FIB mirato in modo efficiente. Con la super risoluzione 3D della crio-SIM e il nostro software crio-CLEM, 3D-View, la precisione di correlazione del targeting della regione di interesse può raggiungere 110 nm sufficienti per la successiva fabbricazione di crio-lamella. Abbiamo utilizzato con successo il sistema HOPE-SIM per preparare crio-lamelle mirate ai mitocondri, ai centrosomi delle cellule HeLa e al compartimento di assemblaggio dell'herpesvirus delle cellule BHK-21 infette, il che suggerisce l'elevata potenza del sistema HOPE-SIM per il futuro cryo-ET in situ flussi di lavoro.

La rivelazione di ultrastrutture cellulari tridimensionali (3D) è un passo importante nella comprensione della vita. Negli ultimi anni, la microscopia crioelettronica (crio-EM) è stata sempre più migliorata e sta diventando una delle principali tecniche biofisiche utilizzate per studiare strutture 3D ad alta risoluzione di complessi macromolecolari1. Inoltre, la tomografia crioelettronica (cryo-ET) è emersa come un altro potente strumento per visualizzare l'organizzazione macromolecolare di paesaggi cellulari imperturbati con il potenziale di raggiungere una risoluzione quasi atomica2,3,4. Per visualizzare l'ultrastruttura subcellulare nelle cellule vetrificate mediante crio-ET, è stata utilizzata la fresatura con fascio ionico focalizzato in condizioni criogeniche (crio-FIB) per preparare sottili criolamelle da cellule vetrificate, consentendo molte interessanti osservazioni biologiche all'interno delle cellule. L'organizzazione tridimensionale degli organelli cellulari, come il citoscheletro5,6,7,8,9, il reticolo endoplasmatico (ER)10 e il proteasoma 26S11 sono stati analizzati con successo mediante crio-ET.

Esistono diverse limitazioni che precludono un’applicazione più ampia della crio-ET, comprese le difficoltà nel localizzare e identificare le caratteristiche di interesse12. La microscopia criocorrelativa ottica ed elettronica (crio-CLEM)13,14,15,16,17,18 ha dimostrato di essere un approccio efficace per superare questo problema utilizzando la marcatura fluorescente per navigare verso il bersaglio per la successiva crio-FIB fresatura di cellule vetrificate14,15,16,17 o imaging crio-ET di sezioni congelate e idratate12,18. Considerando che lo spessore normale delle cellule è ben oltre il percorso libero medio di 300 elettroni keV, è necessaria la fabbricazione di cellule vetrificate con uno spessore di ~ 200 nm prima della raccolta dei dati crio-ET. Pertanto, la procedura sperimentale sequenziale di vetrificazione, microscopia a criofluorescenza (crio-FM), crio-FIB e crio-ET è diventata un flusso di lavoro di routine per molti studi strutturali in situ sito-specifici12,19,20,21,22, 23. Questo flusso di lavoro richiede normalmente un microscopio a fluorescenza autonomo con un criostadio per l'imaging a criofluorescenza15,16,17,24,25, seguito da microscopia elettronica a scansione criogenica (crio-SEM). Un allineamento di correlazione tra le immagini crio-FM e crio-SEM viene generato e utilizzato per guidare la fresatura crio-FIB12,18,21,26. Inoltre, sono necessari marcatori fiduciari specifici ripresi sia da crio-FM che da crio-FIB, come perline fluorescenti, per l'allineamento della correlazione utilizzando uno specifico software correlativo 3D21,27. Sono state segnalate molte implementazioni hardware per realizzare questo flusso di lavoro sviluppando la microscopia criogenica a fluorescenza ad ampio campo13,21,22 o la microscopia confocale crio-Airyscan ad alta risoluzione (CACM)12.

L'accuratezza della correlazione e il tasso di successo tra crio-FM e crio-FIB sono limitati dalla risoluzione della crio-FM e ulteriormente attenuati dai fattori di deformazione del campione, devetrificazione e contaminazione da ghiaccio7,21. In precedenza abbiamo sviluppato un'esclusiva piattaforma ottica ad alto vuoto per crio-CLEM (HOPE)25, che utilizzava un crio-supporto integrativo e una camera a vuoto specifica per ridurre al minimo la contaminazione da ghiaccio e ridurre il rischio di deformazione e devitrificazione del campione durante l'imaging crio-FM e trasferimento del campione. Tuttavia, l'uso di un microscopio a fluorescenza ad ampio campo con una lente obiettivo a bassa apertura numerica (NA) e senza l'informazione della posizione z dei target fluorescenti nel nostro sistema HOPE ha limitato l'accuratezza della correlazione al di sopra di un micron, che deve essere migliorata per aumentare il tasso di successo della fresatura crio-FIB specifica per il sito.